New insights on how bird flu crosses the species barrier

A new publication from the Cusack group sheds light on how a key avian influenza virus enzyme can mutate to allow the virus to replicate in mammals

In recent years, public health measures, surveillance, and vaccination have helped bring about significant progress in reducing the impact of seasonal flu epidemics, caused by human influenza viruses A and B. However, a possible outbreak of avian influenza A (commonly known as ‘bird flu’) in mammals, including humans, poses a significant threat to public health. 

The Cusack group at EMBL Grenoble studies the replication process of influenza viruses. A new study from this group sheds light on the different mutations that the avian influenza virus can undergo to be able to replicate in mammalian cells. 

Some avian influenza strains can cause severe disease and mortality. Fortunately, significant biological differences between birds and mammals normally prevent avian influenza from spreading from birds to other species. To infect mammals, the avian influenza virus must mutate to overcome two main barriers: the ability to enter the cell and to replicate within that cell. To cause an epidemic or pandemic, it must also acquire the ability to be transmitted between humans. 

However, sporadic contamination of wild and domestic mammals by bird flu is becoming increasingly common. Of particular concern is the recent unexpected infection of dairy cows in the USA by an avian H5N1 strain, which risks becoming endemic in cattle. This might facilitate adaptation to humans, and indeed, a few cases of transmission to humans have been reported, so far resulting in only mild symptoms.

At the heart of this process is the polymerase, an enzyme that orchestrates the virus’s replication inside host cells. This flexible protein can rearrange itself according to the different functions it performs during infection. These include transcription – copying the viral RNA into messenger RNA to make viral proteins – and replication – making copies of the viral RNA to package into new viruses.

Viral replication is a complex process to study because it involves two viral polymerases and a host cell protein – ANP32. Together, these three proteins form the replication complex, a molecular machine that carries out replication. ANP32 is known as a ‘chaperone’, meaning that it acts as a stabiliser for certain cellular proteins. It can do this thanks to a key structure – its long acidic tail. In 2015, it was discovered that ANP32 is critical for influenza virus replication, but its function was not fully understood. 

The results of the new study, published in the journal Nature Communications, show that ANP32 acts as a bridge between the two viral polymerases – called replicase and encapsidase. The names reflect the two distinct conformations taken up by the polymerases to perform two different functions – creating copies of the viral RNA (replicase) and packaging the copy inside a protective coating with ANP32’s help (encapsidase). 

Through its tail, ANP32 acts as a stabiliser for the replication complex, allowing it to form within the host cell. Interestingly, the ANP32 tail differs between birds and mammals, although the core of the protein remains very similar. This biological difference explains why the avian influenza virus does not replicate easily in mammals and humans. 

“The key difference between avian and human ANP32 is a 33-amino-acid insertion in the avian tail, and the polymerase has to adapt to this difference,” explained Benoît Arragain, a postdoctoral fellow in the Cusack group and first author of the publication. “For the avian-adapted polymerase to replicate in human cells, it must acquire certain mutations to be able to use human ANP32.”

To better understand this process, Arragain and his collaborators obtained the structure of the replicase and encapsidase conformations of a human-adapted avian influenza polymerase (from strain H7N9) while they were interacting with human ANP32. This structure gives detailed information about which amino acids are important in forming the replication complex and which mutations could allow the avian influenza polymerase to adapt to mammalian cells.

To obtain these results, Arragain carried out in vitro experiments at EMBL Grenoble, using the Eukaryotic Expression Facility, the ISBG biophysical platform, and the cryo-electron microscopy platform available through the Partnership for Structural Biology. “We also collaborated with the Naffakh group at the Institut Pasteur, who carried out cellular experiments,” added Arragain. “In addition, we obtained the structure of the human type B influenza replication complex, which is similar to that of influenza A. The cellular experiments confirmed our structural data.”

These new insights into the influenza replication complex can be used to study polymerase mutations in other similar strains of the avian influenza virus. It is therefore possible to use the structure obtained from the H7N9 strain and adapt it to other strains such as H5N1.

“The threat of a new pandemic caused by highly pathogenic, human-adapted avian influenza strains with a high mortality rate needs to be taken seriously,” said Stephen Cusack, EMBL Grenoble Senior Scientist who led the study and has been studying influenza viruses for 30 years. “One of the key responses to this threat includes monitoring mutations in the virus in the field. Knowing this structure allows us to interpret these mutations and assess if a strain is on the path of adaptation to infect and transmit between mammals.” 

These results are also useful in the long-term perspective of anti-influenza drug development, as there are no existing drugs that target the replication complex specifically. “But it’s just the beginning,” said Cusack. “What we want to do next is to understand how the replication complex works dynamically, in other words, to know in more detail how it actively performs replication.” The group has already successfully carried out similar studies on the role of influenza polymerase in the viral transcription process.

Une nouvelle publication de l’équipe de recherche de Stephen Cusack explique comment une enzyme clé du virus de la grippe aviaire peut muter pour permettre au virus de se répliquer chez les mammifères

Ces dernières années, les mesures de santé publique, la surveillance et la vaccination ont permis de réduire considérablement l’impact des épidémies de grippe saisonnière, causées par les virus de la grippe humaine A et B. Cependant, une éventuelle épidémie de grippe aviaire A (communément appelée “grippe aviaire”) chez les mammifères, y compris l’homme, constituerait une menace importante pour la santé publique. 

L’équipe de recherche de Stephen Cusack, à l’EMBL Grenoble, étudie le processus de réplication des virus de la grippe. Dans une récente publication, cette équipe met en lumière les différentes mutations que le virus de la grippe aviaire peut acquérir pour pouvoir se répliquer dans les cellules des mammifères. 

Certaines souches de grippe aviaire peuvent provoquer des maladies graves et être fatales. Heureusement, d’importantes différences biologiques entre les oiseaux et les mammifères empêchent normalement la grippe aviaire de se propager des oiseaux à d’autres espèces. Pour infecter les mammifères, le virus de la grippe aviaire doit muter pour surmonter deux barrières principales : la capacité de pénétrer dans la cellule et celle de se répliquer à l’intérieur de cette dernière. Pour provoquer une épidémie ou une pandémie, le virus doit également acquérir la capacité de se transmettre entre humains. 

La contamination sporadique des mammifères sauvages et domestiques par la grippe aviaire devient de plus en plus fréquente. La récente infection inattendue de vaches laitières aux États-Unis par une souche aviaire H5N1, qui risque de devenir endémique chez les bovins, est particulièrement préoccupante. En effet, cela pourrait faciliter l’adaptation du virus à l’homme; certains cas de transmission ayant déjà été signalés, mais qui n’ont jusqu’à présent entraîné que des symptômes bénins.

Au cœur de ce processus se trouve la polymérase virale, une enzyme qui orchestre la réplication du virus à l’intérieur des cellules hôtes. Cette protéine flexible peut se réorganiser en fonction des différentes fonctions qu’elle remplit au cours de l’infection. Elle effectue notamment des tâches de transcription (copie de l’ARN viral en ARN messagers pour la fabrication de nouvelles protéines virales) et de réplication (copie de l’ARN viral pour l’empaqueter dans de nouveaux virus).

La réplication est un processus complexe à étudier car elle implique deux polymérases virales et une protéine de la cellule hôte, l’ANP32. Ensemble, ces trois protéines forment le ‘complexe de réplication’, une machine moléculaire qui effectue la réplication. L’ANP32 est connue comme une protéine “chaperon”, ce qui signifie qu’elle agit comme un stabilisateur pour certaines protéines cellulaires. Elle joue ce rôle grâce à un domaine clé : sa longue queue acide. En 2015, il a été découvert que l’ANP32 est essentielle à la réplication du virus de la grippe, mais sa fonction n’était pas entièrement comprise. 

Les résultats de cette nouvelle étude, publiés dans la revue Nature Communications, montrent que l’ANP32 agit comme un pont entre les deux polymérases virales, appelées réplicase et encapsidase. Ces noms reflètent les deux conformations distinctes adoptées par les polymérases pour remplir deux fonctions différentes : créer des copies de l’ARN viral (réplicase) et l’empaqueter à l’aide de l’ANP32 (encapsidase). 

Grâce à sa queue acide, l’ANP32 agit comme un stabilisateur du ‘complexe de réplication’, lui permettant de se former au sein de la cellule hôte. Il est intéressant de noter que la queue de l’ANP32 diffère entre les oiseaux et les mammifères, bien que le cœur de la protéine reste très similaire. Cette différence biologique explique pourquoi le virus de la grippe aviaire ne se réplique pas facilement chez les mammifères et les humains. 

“La différence clé entre l’ANP32 aviaire et humaine réside dans l’insertion de 33 acides aminés dans la queue de l’ANP32 aviaire. La polymérase doit s’adapter à cette différence”, explique Benoît Arragain, postdoctorant dans l’équipe de Stephen Cusack et premier auteur de la publication. “Pour que la polymérase d’un virus de la grippe aviaire copie le génome viral au sein de cellules humaines, elle doit acquérir certaines mutations afin de pouvoir utiliser l’ANP32 humaine.”

Pour mieux comprendre ce processus, Arragain et ses collaborateurs ont obtenu la structure des conformations de la réplicase et de l’encapsidase d’une polymérase de grippe aviaire (de la souche H7N9) adaptée à l’homme, et interagissant avec l’ANP32 humaine. Cette structure fournit des informations détaillées sur les acides aminés importants pour la formation du complexe de réplication et sur les mutations qui pourraient permettre à la polymérase de la grippe aviaire de s’adapter aux cellules de mammifères.

Pour obtenir ces résultats, Arragain a réalisé des expériences in vitro à l’EMBL Grenoble, en utilisant la Plateforme d’expression en cellules eucaryotes, la Plateforme biophysique de l’ISBG et la Plateforme de cryo-microscopie électronique disponible dans le cadre du Partenariat pour la Biologie Structurale. “Nous avons également collaboré avec l’équipe de recherche de Nadia Naffakh, basée à l’Institut Pasteur, qui a réalisé des expériences cellulaires complémentaires”, a ajouté Arragain. “Nous avons également résolu la structure du complexe de réplication de la grippe humaine de type B, qui, dans son architecture, s’est révélée être très proche de celui de la grippe A. Les expériences cellulaires réalisées par nos collaborateurs ont confirmé nos données structurales.”

Ces nouvelles connaissances sur le complexe de réplication de la grippe peuvent être utilisées afin d’étudier les mutations de la polymérase dans d’autres souches similaires au virus de la grippe aviaire. Il est donc possible d’utiliser la structure obtenue à partir de la souche H7N9 et de l’adapter à d’autres souches, telles que H5N1.

“La menace d’une nouvelle pandémie causée par des souches de grippe aviaire hautement pathogènes, adaptées à l’homme et présentant un taux de mortalité élevé, doit être prise au sérieux”, a déclaré Stephen Cusack, chercheur à l’EMBL Grenoble, qui a dirigé l’étude et étudie les virus de la grippe depuis 30 ans. “L’une des principales réponses à cette menace consiste à surveiller les mutations du virus sur le terrain. Connaître cette structure nous permet d’interpréter ces mutations et d’évaluer si une souche est sur la voie de l’adaptation pour infecter et se transmettre aux mammifères.” 

Ces résultats sont également utiles dans la perspective à long terme du développement de médicaments antigrippaux car aucune molécule existante ne cible spécifiquement le complexe de réplication. “Mais ce n’est qu’un début”, a déclaré Cusack. “Ce que nous voulons faire ensuite, c’est comprendre comment le complexe de réplication fonctionne de manière dynamique, en d’autres termes, connaître plus en détail la manière dont il effectue activement la réplication du génome viral.” Le groupe a déjà mené avec succès des études similaires sur le rôle de la polymérase de la grippe dans le processus de transcription virale.

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